Suite à la tentative d'assassinat de la belle Mathilde, fille du célèbre professeur Stangerson, le jeune reporter Joseph Rouletabille, accompagné de son ami et photographe Sainclair, se rend au château du Glandier pour élucider le mystère. Qui est l'agresseur ? Quel est son mobile ? Et surtout, comment a-t-il pu s'échapper de la chambre jaune, fermée de l'intérieur ? Le célèbre inspecteur Frédéric Larsan soupçonne Darzac, le fiancé de mademoiselle Stangerson...