Quand son père disparaît à Venise, Indiana Jones, renseigné par Walter Donovan, quitte les États-Unis et se lance sur ses traces après avoir reçu son journal. À Venise, il rencontre une charmante archéologue autrichienne, Elsa Schneider, qui collaborait avec son père avant sa disparition. Tous les deux découvrent sous une bibliothèque des catacombes inexplorées des chevaliers du Graal et une tombe avec une inscription donnant des indices sur l'emplacement du Graal. Mais tous deux sont bientôt pris en chasse par des membres de la confrérie de l'Épée cruciforme, gardiens de ce secret. Indiana apprend ensuite que son père est séquestré par des Allemands.